glutation lub GSH , jestnieistotne Tripeptyd wykonane z cysteiny , glutaminianu i glicyny . Jestsilnym przeciwutleniaczem, który chroni komórki i narządy ciała przed szkodliwym działaniem ROS lub reaktywnych form tlenu , które są utworzone z tlenem cząsteczkowym w wyniku różnych procesów metabolicznych w organizmie . Przeciwutleniacze , takie jak glutation , neutralizacji ROS i zapobiegania ich oddziaływania z powierzchnią i uszkodzenia DNA i białka z komórek. Stosunek utlenionej i zredukowanej formie GSH w organizmie wskazuje na ROS związanych stresu oksydacyjnego w swoim body.Things musisz
strzykawki Obrazów igły Butterfly Foto wirówki Obrazów heparyny sodowej
Zamrażarka
kwas sulfosalicylowego
GSH środek reakcji Obrazów mikropłytek Obrazów źródło światła Foto standardowej GSH rozwiązania
Pokaż więcej instrukcji
1
Draw około 2 ml krwi przez nakłucie żyły do anticubetal żyły z igłą kalibru motylkowego 23 przymocowanego do 5 ml strzykawki. Próbki do probówek testowych zawierających heparynę sodową i delikatnie obracać rurkę do mieszania .
2
Zebrać czerwone krwinki przez odwirowanie próbki przy 2500 obrotach na minutę przez pięć minut. Zamrażać i rozmrażać próbkę trzy razy złamać komórki . Wirować roztwór lizatu komórek przez 10 minut przy 12000 obrotów na minutę i 4 ° i zebrano supernatant .
3
usunąć białka z próbki, dodaje się 5 procent kwasu sulfosalicylowego i odwirowaniu próbkę 12000 obrotów na minutę przez pięć minut w 4 °. Przechowywać odbiałczano supernatant w -112 stopni .
4
Wymieszać środek wykrywania tiolową GSH reduktazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego i buforu testowego w proporcjach podanych przez producenta zestawu do mieszaniny reakcyjnej GSH . Ilość każdej substancji chemicznej zależy od liczby badań , które zamierzasz wykonać . Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną GSH w 5 procentowym kwasem sulfosalicylowym , aby uzyskać stężenie 16 , 32 , 63 , 125, 250 i 500 mikrolitrów .
5
Dodać 1 do 10 mikrolitrów pozbawionej próbki krwi do studzienek mikropłytki . Dodaj seryjnie rozcieńczonego roztworu wzorcowego GSH , który jest dostępny w zestawie testowym , do każdej studzienki , aby całkowita objętość każdego dołka 10 mikrolitrami .
6
Dodaj 90 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej GSH , że wprowadzone w etapie 4 do każdego dołka mikropłytki . Wymieszać odczynnik , potrząsając płytkę na 30 sekund .
7
natychmiast Zmierzyć absorbancję umieszczając płytkę w świetle o długości fali 405 i 415 nm . Inkubować płytki w ciągu 30 minut. Odczytów absorbancji po co pięć minut w czasie inkubacji .
8
rozcieńczyć 6 milimolowej przetworzonego próbki z 5 procent kwasu sulfosalicylowego i rozwiązania trifluromethane sulfonianu . Spowoduje to usunięcie wszystkich obniżonej GSH z roztworu . Dodaj 1 do 10 micoliters tego roztworu do dołków mikropłytki i powtórz kroki 5 , 6 i 7 . Pozwoli to oszacować ilość utlenionego GSH w próbce .
9
Wykreślić absorbancję i próbki stężenia na wykresie , aby uzyskać krzywą GSH zarówno zredukowanego i utlenionego glutationu . Obliczyć stosunek obu form GSH . Zwiększone stężenia GSH poziomy oksydacyjnego stresu oksydacyjnego i wskazuje ROS . Imperium