glutation GSH jestbiałkiem występującym zarówno roślin i zwierząt. To działa , aby pomóc reakcji enzymatycznych w detoksykacji zanieczyszczeń środowiskowych . Ponadto ułatwia transport aminokwasów w komórkach i pomaga utrzymać reakcje redukcji sulfhydrylową białka. Protokoły GSH testu użyć buforów GSH , standardy, substrat , enzymy i odczynników . Po specjalnej procedury jest istotne dla wyniku testu . Metoda recyklingu enzymatyczna
enzymatyczna metoda recyklingu, GSH , wykorzystuje reduktazy glutationu ilościowego GSH . Protokół ten jest przeznaczony do osocza , tkanki lub próbki komórek hodowanych . Dodanie reagenta DTNB (kwasu 5 -5′ – ditio – bis – 2 – nitrobenzoesowy ) do GSH . Grupa sulfhydrylowa w GSH reaguje z odczynnikiem i wytwarza kwas żółty nazwie 5 – tio – 2 – nitrobenzoesowego ( TNB ) . Reduktazę glutationową dodanie do mieszaniny kwasu i GSH i GSH recyklingu produkują więcej kwasu. W tej procedurze,wydajność produkcji kwasu jest proporcjonalna do reakcji recyklingu glutationu ; Dlatego , pomiar absorbancji kwasu TNB stosując spektrofotometr. Absorbancja zapewnia oszacowanie rzeczywistej ilości GSH w próbce.
Test glutationu komórki wątroby
Protokół ten analizuje ilość GSH w ludzkiej raka wątroby (rak wątroby ) komórki . Aby przeprowadzić tę procedurę , należy użyć metody kolorymetryczne dla GSH determinacji do zmniejszenia i utlenienia GSH . Zmniejszenie GSH stosując 5 -5′ – ditiobis ( 2-nitrobenzoesowy albo DTNB ), tworząc
zabarwiony produkt kwas 2 – nitro -5 – tiobenzoesowy i utleniony glutation ( GSSG ). Użyj reduktazy glutationu zredukować do postaci GSH GSSG ponownie . W celu pomiaru ilości GSH w komórkach wątroby , przeczytaj próbkę przy 415 absorbancji kinetycznie na czytniku mikropłytek . Imperium komórkowy Apoptoza
W tym protokół GSH jest stosowany do wykrywania śmierci komórek ( apoptozy ) poprzez pomiar spadku zmniejszonym GSH . Spadek stężenia komórek GSH mawskaźnik śmierci komórek. Plamić komórki z przykładowych niefluorescencyjnego thiolite zieleni . Thiolite zielony gromadzi się w cytozolu ( w osoczu komórek) i mitochondriów ( elektrownia ) ogniwa. Użyj cytometru przy 490/520 nanometrów do wizualizacji ilości GSH w komórkach .
Całkowitego stężenia GSH w próbkach roślin i zwierząt
pomiaru stężenia całkowita GSH zarówno w postaci utlenionej i zredukowanej w różnych próbek zwierzęcych i roślinnych. Dodać odczynnik tiolowy ogólnym 5 , 5 ‚- ditiobis – [ kwas 2 – nitrobenzoesowy ]. Odczynnik tiolowy reaguje z GSH , tworząc chromofor 412 nm , kwas 5 – thionitrobenzoic ( TNB ) i GS – TNB . Dodaj reduktazy glutationu i beta – fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego ( NADPH ), aby zmniejszyć GS -TNB . Glutation także zwolnić drugą cząsteczkę TMB i recyklingu GSH . Ponadto dowolną utlenioną GSH ( GSSG ) w mieszaninie fromed z reakcji dwusiarczkowym zmniejsza się również do glutationu . Użyj czytnika mikropłytek przy 405 nm do odczytu poziom absorbancji i wskazać całkowite stężenie GSH . Imperium