eksperymenty in vitro są te prowadzone poza żywym organizmem w probówce lub podobnego środowiska. Naukowcy mogą wykonywać kopie RNA lub transkrypcje genu in vitro w procesie zwanym w transkrypcji in vitro . Enzym, który wytwarza transkrypt RNA opiera się na genie nazywapolimerazy RNA . Jednym z takich cząsteczkapolimerazy SP6 . To wymaga odcinek DNA zwany promotor SP6 , aby mogła funkcjonować prawidłowo . Promotory
PromotorRegion DNA związany polimerazy RNA w celu zainicjowania transkrypcji. Polimerazę SP6 wymagabardzo specyficzna sekwencja występuje w promotora w celu związania , więc gdypolimerazy SP6 służy do transkrypcji in vitro ,gen musi zawierać promotora SP6 na transkrypcję. Polimerazę SP6 jest od typu wirusa nazywanybakteriofaga ; firm biotechnologicznych produkcji tego polimerazy przez zakażenie bakteriami salmonelli z faga , a następnie wyodrębnienie polimerazy .
Ekspresja
podstawową ekspresję lub aktywność odnosi się do poziomu ekspresji w przypadku braku inne cząsteczki , które zwiększają lub zmniejszają poziom transkrypcji . Lub represorów aktywatorów , na przykład, są to białka , które wiążą się z promotora lub innych regionów regulacyjnych genu i albo pomagające w rekrutacji polimerazy RNA, lub zapobiegania jego wiązaniu . Induktory są cząsteczki , które zwiększają wytwarzanie produktu genu poprzez podniesienie poziomu ekspresji . Imperium SP6
Podstawowa działalność dla promotora SP6 będą się różnić w zależności od warunków eksperyment . Najważniejszym czynnikiem , oczywiście, jest to jak może wpłynąć na warunki doświadczalne jak SP6 aktywność i porównuje do innych systemów . W ogóle, polimerazy SP6 i promotorzy dostarczyć mniejszą skuteczność niż in vitro systemów transkrypcji T7 lub T3 , chociaż w idealnych warunkach SP6 jest mniej więcej porównywalna do tych dwóch pozostałych. Jak SP6 , T7 i T3 zarówno używać polimerazy RNA z bakteriofaga .
Warunki
stężenia soli i temperatury są dwa ważne czynniki określające działalność podstawową . SP6 jest bardzo wrażliwy na stężenie soli , tak, że wyższe stężenia soli może zmniejszać swą aktywność w znacznym stopniu . Wszystko inne pozostałe równe , ekspresja jest znacznie większa na 104 stopni Celsjusza niż 99 stopni Celsjusza . Stężenie nukleotydów jest kolejnym ważnym czynnikiem. Niskie stężenia mogą potencjalnie spowodować przedwczesne zakończenie transkrypcji i tym samym zmniejszyć skuteczność. Zwiększenie stężenia nukleotydową będzie uniknąć tego problemu. Jeśli syntezy sond RNA , jednak dodanie zbyt dużo znakowanego nukleotydu zmniejszy ilość znakowanego nukleotydu w produkcie końcowym . Imperium