eksperyment patch-clamp jest używany do pomiaru pojedynczych żywych komórek. Czyni to z bardzo cienkiej pipety , która odbyła się dokładnie na błonie jednolitego komórki (otoczki ochronne ) . Otwarcie tego pipety tylko około 1 mikrona (jedna tysięczna milimetra ) i jest sterowane optycznie za pomocą mikroskopu . Komórki są utrzymywane w naczyniu jednolity za pomocą urządzenia odłączającego komórek, takich jak trypsyna . Specyficzna komórka wybrana ikońcówki pipety jest wprowadzona do błony komórkowej. Uszczelnienie jest utworzone za pomocą ssania i część membrany jest wciągane do pipette.Things musisz Foto płytki komórkowej
sól fizjologiczna buforowana fosforanami lub PBS ( bez wapnia i magnezu )
trypsyny
Inkubator
10 – mililitrowej pipety Foto HEK ( keratinocyctes ludzkiego naskórka ) średni
płodowej surowicy cielęcej ( FCS ) Foto wirówki Obrazów rozwiązania nagrywania zewnętrznego układ zaciskowy
patch
Twist czapka
Elektroda
Pokaż więcej instrukcji
1
uzyskać płytę dla komórek . Płytkę przemywa się dwukrotnie 10 ml PBS ( solanka buforowana fosforanem) bez wapnia i magnezu. Dodać 2 ml Detacher ( trypsyny ) . Inkubować płytki przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Obserwować płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki zostały oderwane . Delikatnie przenieść płytę do odłączenia wszystkich komórek z dna płytki. Dodaj 10 ml ( człowieka keratinocyctes HEK naskórkowe ) i FCS średnim ( płodowej surowicy krów ) . Użyj pipety 10 – mililitr przenieść komórki w górę iw dół .
2
Przestrzegać komórki pod mikroskopem , aby zapewnić , że są pojedyncze komórki . Pipety pomocą pipety 10 – mililitr aż komórki są pojedyncze, w razie potrzeby. Wirować komórki przez dwie minuty przy 1000 obrotach na minutę. Odrzucić supernatant . Umieszczenie komórek w 10 ml płodowej surowicy cielęcej . Odwirować komórki ponownie przez dwie minuty przy 1000 obrotach na minutę. Odrzucić supernatant . Umieszczenie komórek w 200 mikrolitrach zewnętrznej roztworu zapisu. Obserwować komórki pod mikroskopem pojedynczych komórek z gładkiej membrany.
3
Umieścić roztwór soli wewnątrz układu patch clamp . Dodać kroplę wewnątrzkomórkowego roztworu elektrolitu do dolnej części wióra przy użyciu pipety . Zamontować procesor na czapce krętego . Zakrętką zawiera elektrodę odniesienia oraz linię ssącą . Dodać kroplę zewnątrzkomórkowej roztworu elektrolitu do góry za pomocą pipety układzie . Roztwór elektrolitu pozwala na chipie stykają się z elektrodą. Dodanie 5 mikrolitrów zawiesiny komórek w roztworze soli fizjologicznej w układzie scalonym. Umieść jedną komórkę za pomocą ssania przez pipety . Ssanie może być wykonywane ręcznie poprzez zasysanie powietrza poprzez pipety. Pozycjonowania zwiększa odporność komórek w celu utworzenia uszczelnienia . Uszczelnienie umożliwia dochodzenia całej komórki. Imperium